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注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動力學；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個反應(yīng)加入的量 N個反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
β-DPN三(羥甲基)氨烷鹽酸鹽 99%Cbz-L-蘇氨酸芐酯 98%

β-DPNH三(羥甲基)氨烷鹽酸鹽 超純級N-叔丁氧羰基-L-天冬氨酸 4-叔丁酯二環(huán)己胺鹽  98%

NADH Inhibitor用于分子生物學和細胞培養(yǎng)，≥99.0% (AT)叔丁氧羰酰基正亮氨酸二環(huán)己胺鹽   ≥98.5%

TPNN-乙基-N-（2-羥基-3-磺基）-3-胺鈉鹽 99%N-Boc-L-亮氨  97%

TPNH2 Na4N-三(羥甲基)甲基-3-氨基磺酸 99%4-溴咪唑 97%

Coenzyme Q10N-三(羥甲基)甲基-3-氨基磺酸 ≥99.5% (T)(溴甲基)環(huán)丁烷 98%

COA用于細胞培養(yǎng)級, ≥99.5%(T)4-氯-3-乙酮 80%

3C protease八烷基*基氯化銨 99%2-氯-3-甲酸 99%

Lysing Enzymes2,4,6-三溴-3-羥基苯甲酸 98%2-(2-吡啶酮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟酸鹽  99%

XylanaseN-三(羥甲基)甲氨基-2-羥基磺酸 99%3,5-二氯芐胺 97%

ASON-三(羥甲基)甲氨基-2-羥基磺酸 超純級D-2,4-二氨基丁酸 99%

Alcohol dehydrogenaseN-(3-磺基)-3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺鈉鹽 99%D-(-)-二乙酯 99%

Driselase三(羥甲基)甲基甘氨酸 for cell culture，≥99.5%(T) 2-氟-3-(三氟甲基)苯甲酸 98%

XODBiological stain，生化試劑級Fmoc-L-烯基甘氨酸 98%

SODBiological stain，生化試劑級4-氟-3-甲酸 98%

Thrombin溶性四氮唑-8 98%4-氟苯甲酰乙酸甲酯 98%

2-苯基苯酚(標準品)Phospho-Histone H3 (Ser10) (D7N8E) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)Nuclear Matrix Protein p84/NMP84   核基質(zhì)p84蛋白抗體

正戊(分析標準品,≥99.8%(GC))Jak1 (E3A6M) Rabbit mAbNUCKS1  核酪蛋白激酶和細胞周期蛋白依賴性激酶底物1抗體

菲標準溶液(395μg/mL,基體:甲)Cyclin H AntibodyNUBP2  核苷酸結(jié)合蛋白2抗體

菲(標準品)Cyclin H AntibodyNUBP1  核苷酸結(jié)合蛋白1抗體

標準溶液(1.00mg/ml,基體:甲)DAPK3/ZIPK AntibodyNUAK2  SNF1/AMP激酶相關(guān)激酶2抗體

吡啶(標準品)EpCAM (VU1D9) Mouse mAbNTN3/Netrin-3  軸突生長誘導因子3抗體

3-氯聯(lián)苯(標準品)Phospho-PSD93 (Tyr340) AntibodyNtn1  軸突導向因子1抗體

4-氯聯(lián)苯(標準品)Bim (C34C5) Rabbit mAbNTF97/KPNB1  親核素β1抗體

2,2,5-三氯聯(lián)苯(標準品)Bim (C34C5) Rabbit mAbNTCP/SLC10A1  鈉離子/牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運蛋白

2,2,5,5-四氯聯(lián)苯(標準品)Histone H2B (53H3) Mouse mAbNTAL  B淋巴細胞鏈接激活蛋白抗體
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